518年，禁卫军首领查斯丁一世(又译查士丁一世)即皇帝位，他作为侄子被指定为继位人。
527年被授予奥古斯都尊号，与叔父共同执政。同年8月，查士丁去世，他成为唯一的君主。
532年查士丁尼一世镇压尼卡起义，重建圣索菲亚大教堂。为缓东罗马天主教(东正教)与一性派之间的矛盾，于553年主持了东罗马天主教和一性派主教的联合会议。为了征服周边国家，恢复对西罗马故土的统治，查士丁尼一世在东方与波斯萨珊王朝进行长期战争(527～532，540～561) 。他即位后，重用以贝利萨留为首的几员将领，使拜占庭战胜了波斯军队。
532年达成永久性的和平协定，波斯承认拜占庭对西亚地区的宗主权。
533年起，查士丁尼一世集中兵力向西发动战争。
534年派贝利萨留灭汪达尔-阿兰王国，兼并北非，占领撒丁岛和科西嘉岛。查士丁尼为统治被征服的领土，在迦太基设立阿非利加长官府和督军署。查士丁尼把被汪达尔人侵占的土地发还给当地居民和天主教会。为了庆祝国土的光复，君士坦丁堡为贝利萨留举行盛大的凯旋仪式。
535年侵入东哥特王国，遭到猛烈抵抗。552年出兵干涉西哥特王国，占领西班牙东南部。554年最终灭东哥特王国。
541年波斯军队又从北方侵入拉齐卡地区。查士丁尼再次任命贝利萨留指挥东方战场，进行一系列反击。双方约在561年底媾和，签订为期50年的和约。长期的对外战争消耗了国家的大量军事和经济实力，他的继承人最终也未能制止斯拉夫人、保加尔人、匈人残部和阿瓦尔人的不断入侵。
565年查士丁尼一世去世后不久，征服地区大都丧失。
