建立一个蛋白分离纯化实验室需要什么设备
1. 前处理
把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢
失生物活性。常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。
超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压，这个低气压使液体转化为气体
，即形成很多小气泡。由于局部压力的转换，压力重新升高，气泡崩溃。崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中，形成剪切力使细胞破碎。
2． 粗分级
分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，
3． 细分级
样品的进一步纯化。样品经粗分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。
结晶是最后的一步
分离纯化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.电荷；4.吸附性质；5.对配体分子的生物亲和力等。
(一)根据分子大小不同的纯化方法
1. 透析
利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。
2. 密度梯度离心。
蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。
3. 凝胶过滤
利用蛋白质分子大小，因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。大分子先被洗脱下来。小分子后被洗脱
蛋白的分离纯化步骤和所需实验器材，实验试剂
A、NaOH溶液与NH4NO3溶液混合会放出氨气而与K2SO4溶液不反应，所以可用NaOH溶液检验NH4NO3溶液和K2SO4溶液，故A正确；B、CuSO4溶液和氢氧化钾反应生成氢氧化铜沉淀和硫酸钾，而硫酸钾属于新的杂质，所以不能用CuSO4溶液除去KNO3溶液中的杂质KOH，故B错误；C、二氧化锰难溶于水，所以可用过滤或蒸发的方法从H2O2溶液制氧气的残余物中分离出MnO2，故C正确；D、稀盐酸和硫酸钾溶液不反应、和硝酸银溶液反应生成氯化银白色沉淀、和碳酸钠溶液反应生成二氧化碳气体，所以可用稀盐酸区分失去标签的K2SO4、AgNO3和Na2CO3溶液，故D正确．故选B．
基因工程蛋白质分离的原理
基因工程技术原理 西北师范大学 又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。
简单、快捷，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。
在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相在缩短了。
所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。
同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物。
它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。
如果细胞层白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标己都将集中出现在凝胶的底部；
反之，将会形成DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。
基因工程对酶（或者是蛋白质）的分离纯化的贡献有哪些？或者说该怎么写？
结合楼主的补充和我自己的理解，我想到如下：
1，借组基因工程，很多早前只能通过天然提取的酶、蛋白质或多肽，可以重组表达（原核、酵母或真核细胞），大大提高其产量、安全性和浓度，便于后续的分离及纯化；
2，（楼主已说）基因工程重组，可在重组蛋白上添加标签，使其便于利用亲和层析等手段进一步分离与纯化，使纯化工艺更简便，所得蛋白纯度和产量提高；
3，基因工程重组，可提高某些蛋白的可溶性，使酶或蛋白的结构及活性在纯化和分离过程中能保持的更好。
题目只问到在“分离纯化”中的贡献，其实基因工程在重组酶或蛋白中的贡献很多，若果楼主觉得这样回答还是单薄，可以把相关内容加进去。
临时总结，必有疏漏，欢迎其他朋友补充。
蛋白质分享纯化都有哪些方法，具体的步骤是什么？
①浊点萃取法(CPE)： 浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。
CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5％)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。
②置换色谱法：置换色谱(displacement chromatography)作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱。置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方。
③亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
④电泳法：各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
蛋白质的纯化方法有哪些？原理是什么
蛋白质分离纯化常用方法有：
1、沉淀，
2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析：
a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
生物学在军事上有什么领域？
神经武器打造“超人”士兵
生物学家之所以对神经系统特别感兴趣，究其内在原因，是因为在治疗精神疾病、疼痛及其他重要的神经系统紊乱疾病方面，新型药物的开发具有巨大的经济市场。一旦人们了解了痛苦、抑郁、恐慌、创伤后应激、焦虑症、精神分裂症和睡眠障碍等现象背后的详细机制，人们就能设计出比现有药物更高效、更具针对性的新型药物，而且还将大大降低副作用。人道主义和经济激励措施的结合将确保这样的进展将是十分迅速的。
当然，就像所有先进技术一样，这些新出现的能力既能用于和平目的，也能用于敌对目的。这些敌对的应用包括：操纵人类以增强士兵的机能；创建新型作战武器，特别是一系列使人丧失生化机能的非致命武器；用于审讯的新型药剂等。
●“超人”士兵
至少半个世纪以来，军队曾使用安非他命作为兴奋剂，帮助飞行员或士兵执行长期任务。在未来，可以预见的是，至少某些国家可能会使用这些强制性药物锻造出一支这样的军队，他们不仅能在好几天的时间里保持警觉和精力充沛，而且还能提高士兵感官意识、增强攻击能力、减少恐惧、降低对疼痛的敏感性及压制道德感。科学家们正在着手了解这些属性的化学基础，开发出可提供上述能力的药物并非异想天开。进一步展望未来，随着对增强身体机能之生化基础的了解，士兵将比普通人更为强健和快速，街头执法者将普遍拥有超人的力量。一旦了解了抑郁的分子基础，选择性地擦除记忆也将成为可能，敏感任务的介绍和汇报工作中将包括删除选定的记忆。
●生化武器
关于神经系统的新知识可能还会催生出新的化学武器。值得注意的是，目前最致命的化学武器———神经毒剂就是乙酰胆碱的相似物，乙酰胆碱是一种用于大量不同神经和神经肌肉回路中的神经递质。随着对神经回路的深入了解，人们有充分的理由相信更具威力的毒剂也必将面世。更具意义的是，还有可能开发出一种全新的非致命生化武器。
●生化审讯
新型药物还可能会引起审讯者的极大兴趣，这样他们就可以绕过关于审讯的法律限制。也许要造出一种能使被审讯者真正吐露实情的“真相血清”并不可能，但新型药物将大大降低被审讯者抵御招供的能力。一种可引发顺从、渴望乃至愉悦的化学制剂已正在研发过程中，未来将可有效地使用在许多俘虏身上。通过抑郁、妄想、恐慌和顺从等技术手段的操控，甚至交替使用兴奋、愉悦等手段，这种医药形式的“酷刑”将无坚不摧，很少有俘虏能抵挡得住这样的折磨，最终只能乖乖地将保守的秘密全盘供出。
可怕的病原体武器
病原（致病）细菌或病毒引发疾病的机理是很复杂的。然而，对发病过程的理解正在取得非常迅速的进展，这将大大增强公众健康水平、提高农业生产效益。
这些很快就能得到的工具将可用于生产更高效、更持久、更安全的改进型的疫苗，生产新型抗生素和抗病毒药物，增强疾病抵御能力，并防止过度损害身体的防御系统；兽药领域同样也可从中获益；对植物疾病的深入了解预计也可提供更多的产能并改善其营养品质。
正如对神经系统的深入了解一样，对发病机理的深入了解也同样为其潜在的军事用途开启了大门。在下一个十年里，这些潜在的军事用途包括：可规避诊断和治疗的遗传工程病原体；非常致命的病原体；可永久致人瘫痪的病原体；带有增强传染性的病原体；带有增强环境稳定性的病原体。
●规避诊断和治疗
创建耐抗生素病原体的技术已存在了几十年，使用病毒或细菌的变异形式来混淆诊断也并不新鲜。但是，新技术可使这些变异病原体的构建更为容易和快速，并提供了一系列新的选项。
到目前为止，这些病原体的开发一直受限于与其他特性间的相互毒性。如果科学家改变病原体中的一个特性，如干扰疫苗或诊断的表面蛋白，他们将普遍降低毒性。不久的将来，科学家们也许可对药剂的性能进行操纵，并避免这些不良的副作用。
●强烈的致命性或致残性
在自然界中，病原体的毒性是由一个复杂的选择过程引发的，这个过程往往会限制毒性的转播，病原体杀死宿主是如此之快，以至于它基本上没有机会转移到其他新的宿主，从而会很快地死去。而长期存在于实验室中的微生物可免去这样的选择，因此，与现有病原体相比，基因工程生物体也许将达至非常高和非常快的杀伤力。这可不是猜测，这已经得到了证实：当一个与免疫系统相关的小鼠基因被纳入其DNA时，一种带有极低毒性的鼠痘病毒就会变得具有高致命性。这种潜在的高致命性生物武器制剂的开发，对新一轮的军备竞赛构成了一个重大风险，也引起了对生物安全性的高度关注，因为军事实验室中的一次小小事故可能会无意中释放出超常危险的病原体。
研究人员所能做的还不仅限于将良性病毒转化成致命的毒剂，令人更为不安的是，他们还可对病毒进行设计生产出以药物激活的化合物，这能引起一系列的禁能效应，轻则迷失方向，重则精神错乱。这些病毒还具有传染性，并像疱疹病毒和逆转录病毒一样可在体内保留多年，造成永久性的、可传染的精神或身体残疾。
●更快、更久地传播疾病
目前，许多病原体从一个宿主扩散到另一个宿主的能力是非常有限的。但是，新技术有可能会改变这种情况，至少对于某些病原体来说，创建出一个具有更多或更少传染性的变异体是有可能的。当然，这个特性可与高致命性结合起来。例如，猴痘病毒经设计后可在人群中传染，其杀伤力大大增强，从而成为一种危害甚于天花的可怕武器。
将自然发生的微生物转移到军事武器中的障碍之一，就是病原体释放时其持续时间非常有限，有时只能以分钟来计量。例如，鼠疫在以肺炎形式传播时具有可怕的致命性，但其传播距离只是很短的几米远，主要原因在于其气溶胶形式存活时间非常的短。出于此种原因，美国在其进攻性生物武器计划发展进程中并没有将其成功地武器化，尽管前苏联做到了。更深入地了解为什么某些细菌能长时间存活而其他一些则不能的原因，则有可能使得某些修改后的病原体存活时间更长，从而成为候选的生化武器。
未来的生物技术武器
从20年甚至更长的时间来看，我们可以预计，上述技术不仅会得到长足的发展，而且还会涌现出更多的新技术。这些可能的新技术包括：合成病毒和朊病毒；作为生化制剂载体的非复制、合成的类细胞实体；隐形病原体；农作物和家庭饲养禽畜的特定基因性病原体；特定民族的人类病原体；可引发特定种族自身免疫性疾病（如不育）的病原体等。
●人造病毒
新生物学最引人注目的发展之一便是其已近在眼前的创造合成生命系统的能力。通过众所周知的核酸和蛋白质生命进程，这种生命从某种意义上说可对自身进行自我复制。合成现有病毒的复制品已可通过化学方法获得，科学家们正在不断努力以合成出细胞生命。全新人造病毒的面世也将为时不远。接下来，高效的、新型人造病毒性病原体的生产也就成了顺理成章之事。对于生物防治病虫害（如杂草、老鼠、昆虫等）来说，此类制剂具有明显的效用，因此该类技术的发展一定会得到大力推动。
但是，此类经验也很容易被移植到武器研制上。人造病毒可被设计成具有传染性或非传染性、致死性或致残性、急性或慢性等等，对免疫系统来说，它们将是无形的，并能抵御各种现有的抗病毒治疗。在首次使用时，它们将是非常难以诊断的。同样，对感染蛋白制剂的可自我循环的朊病毒加以深入研究，人们将有可能开发出新的、合成形式的此类制剂。
生命合成细胞将可能在未来10年面世，比野生病原体或经基因改造的天然病原体更加有效的合成病原体也将在其后的某个时候出现。这类人造细胞病原体也具有和人造病毒完全一样的特性。
创造可用于针对特定组织生化制剂的新型类细胞实体也是可能的。它们在医药领域将大有用武之地，可允许药剂针对特定的组织发生作用，当然，它们在武器制剂的开发方面具有同样的潜力。
●隐身病原体
科学家们还可设计出相当于休眠细胞的微生物———隐身病原体。这些病原体，无论是天然的还是人工合成的，将被设计成以轻微症状或毫无症状的形式潜伏起来，一旦给以某一特定刺激便可激发出相应症状。这样的一个病原体将可通过易感人群悄无声息地加以传播，所有的感染者在之后的某个时间（如将良性化合物添加到诸如饮水或入口食材中）便可诱发出相应症状，这些症状将会致命或致残。
●特定基因型生物武器
人们一直在谈论特定种族或特定基因型的生物武器，它们在技术上是完全可行的。它们最容易将农业目标作为攻击的对象，因为耕种作物和家养动物往往具有很少的遗传变异。比如，这样的特定基因型武器可专门针对某个国家广泛种植的作物品种。尤其是转基因作物的迅速增加，为经过设计的病原体提供了遗传靶标，或使特定农作物或动物品种独有的自然遗传序列成为攻击目标。
设计针对人类的特定种族武器要困难得多，因为无论在种群内还是种群间人类的遗传变异非常大。虽然单个性状和某个种族并不具有高相关性，但还是有可能找到和某个种族具有高相关性的性状组合。将这样的组合作为病原体特异性的基础，为遗传工程学出了一个巨大的难题，但没有理由相信它最终不会成为可能。一旦成为现实，病原体就可以被设计成基本上只针对某个种族或是民族群体。
如果这样的武器都能设想得到，那么它们可能还会产生以下的后果：不孕症、精神疾病或是其他明显不属于生物武器攻击造成的残疾。通过设计病原体制造出生物调节器，即可造成精神疾病；通过引发精子或卵子蛋白的自发免疫反应，就能导致不孕症，这种方法目前已广泛用于生物防治病虫害。这种传染性不孕症，如果再加上某个特定种族目标因素，也许在很长的时间里都无法察觉，因为目标群体的生育率是逐渐下降的。
抗体蛋白质纯化的好方法
抗体纯化分了几种类型，根据用途决定选择哪种方法进行纯化：
1. 粗纯：将制备抗体的血清或是腹水，细胞上清，直接用盐析法进行处理，这样可以将这些物质里面的其他杂质去掉，获得蛋白的成分，但是由于是粗纯，里面会混有大量的其他蛋白，这样获得的抗体，纯度较低，用于实验中背景比较高。
2.通用型纯化：用抗体结合蛋白Protein A，Protein G或者Protein L。因为不同来源的抗体和这些抗体结合蛋白的结合能力不同，所以需要根据抗体来源选择使用哪种抗体将诶和蛋白最好。对于有一些单链抗体，则多半使用protein L来进行纯化。经过抗体结合蛋白的亲和纯化后，溶液中基本只保留了抗体的成分，其他蛋白都去掉了，抗体纯度可以比较高。相对来说，这种方法是大规模抗体制备中，用得最多的纯化方法，很多抗体公司都采用这种方法来对抗体进行纯化。
3.特异型纯化：但是有些抗体，需要纯度特别高，特异性特别好，就不能简单采用上述两种方法进行纯化了。必须要通过将抗原固定制备成特异的亲和纯化柱，再纯化抗体。这个时候得到的就全是针对一种抗原的抗体了，特异性最好。当然，由于牵涉到抗原固定等操作，成本相应是最高的。
蛋白的表达与纯化
pET，原核表达金标准（转）
pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点
· 是原核蛋白表达引用最多的系统
· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低
· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制
· 提供各种不同融合标签和表达系统配置
· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌
· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物
· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pET 系统概述
pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平
pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株
质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 λ DE3 溶原菌。
有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导 λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性 T7 lac 启动子
除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。
在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。
控制诱导的表达水平
在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。
选择 pET 载体
所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：
转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）
翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。
选择要点
选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：
· 所表达蛋白的用途
· 所表达蛋白的已知信息
· 克隆策略
pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。
任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。
由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。
溶解性和细胞定位
考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。
特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。
获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。
一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b （ + ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。
满足不同需要的融合标签
如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。
使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。
His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。
CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。
Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。
各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。
pET NusA 融合系统 43.1
在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白
新推出的 pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000 个以上蛋白进行可溶性建模， NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA 融合蛋白进行的试验中，大于 85% 的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1 载体含有 Nus.Tag 融合伴侣并与 trx/gor 突变体 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1 载体和这些 trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。
优点
· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侣
· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可选择的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合标签
· 凝血酶和肠激酶切割位点
· 多克隆位点位于所有读码框中
· 与 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭
pET 宿主菌株感受态细胞
所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。
（ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。
AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。
B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。
BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。
BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。
BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。
HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。
NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。
Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。
Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。
Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。
Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。
重组蛋白的纯化
http://www.bioon.com/experiment/protein4/86143.shtml
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蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了。
说说我的蛋白表达纯化以及单抗制作概要吧：
1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取
2 构建表达载体：根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑；但是有些基因在E coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑（原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好），有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。，这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要
3 载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清（分泌型）或者破碎细胞（胞内表达的蛋白）电泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白
4 蛋白表达成功，下面是根据蛋白质本身亲水/疏水，电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤：离心，取蛋白所在的相
如果是分泌表达的蛋白，则取上清，超滤，没有超滤仪器可以用透析袋等代替，用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95％的蛋白，电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求，可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS－标签，这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化，在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候，也可以单单用抗HIS的抗体做一WB，分析确认目的蛋白是否表达，这是蛋白表达的常用手段。
5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐，如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干，得到纯蛋白。
常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离.
常见的分离提纯蛋白质的方法有：1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀.2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动.电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开.4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量.5、分子筛：又称凝胶过滤法,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比.
