酵母利用甲醇诱导还是组成性表达好
用甲醇诱导毕赤酵母表达目的蛋白前,为什么用甘油扩菌
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用,应用此系统可高水平表达蛋白,且具有翻译后修饰功能,故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。
常用的酵母表达系统:
一,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统:
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史,被认为是GRAS(generally recognized as safe)生物,不产生毒素,已被美国FDA确认为安全性生物,但酿酒酵母难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质,也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此,一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌
二,甲醇营养型酵母表达系统:
甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula),毕赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis)等,并以毕赤酵母属(Pichia)应用最多。
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中,大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1),在该基因的启动子(PAOX1)作用下,外源基因得以表达。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞,不会发生超糖基化。
酵母表达的特点酵母是一种单细胞低等真核生物,培养条件普通,生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本。
巴斯德毕赤酵母 对人体有害吗
十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白(SCP),有很好的发酵基础,菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源,廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长,其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能,可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态,而在培养液中加入甲醇后,外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器,其中大量合成过氧化物酶,因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中,可免受蛋白酶的降解,且不对细胞产生毒害。
关于SDS-PAGE电泳
1.一般来说,加样孔还是足够深的应该有(1cm),如果觉得比较浅可以多加一点浓缩胶,用来压制胶水平的水或乙醇一点点就可以了。
2.如果只是两边的孔走样,中间的没问题的话,两边的孔加样后条带不直,很可能是电泳槽下面的气泡没有排尽,或者根本就没有注意下面有气泡,另外在电泳过程中因为会产生热,也会产生气泡,如果有可以用滴管吹打排出。气泡不导电,当然会破坏均匀的直流电场,条带就不直了。
另外,为了防止产热,可以将电泳槽放在冰水中散热。电泳过程影响因素较多,为了安全起见,尽量不要用两边的孔。