聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒
以下是索莱宝的聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒介绍（仅供参考）
本试剂盒采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。使用本试剂盒回收的DNA可适用于后续各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。
操作步骤：
第一次使用前请先在15ml漂洗液中加入60ml无水乙醇，所有离心步骤均可使用台式离心机在室温下离心。
1．将单一的目的DNA条带从聚丙烯酰胺凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入1.5ml离心管中，称取重量，用研磨杵将胶尽量挤压碎。加入2倍体积的提取液吹打混匀（每100mg胶加入200ul提取液），75℃水浴30分钟。
2．用1ml的去尖吸头吸取混合物至过滤柱中（将胶一起吸入，溶液过多时可分次加入），13,000rpm离心1分钟。将收集管中的滤出液转入新离心管中。
3. 取6倍体积结合液加入原离心管中（每100mg胶加入600ul），清洗管壁后加入过滤柱中(溶液过多时可分次加入)，颠倒过滤柱或轻轻吹打几次混匀，13,000rpm离心1分钟。将所有收集的滤出液混合。
4．将总滤出液混匀后加入吸附柱中（溶液过多时可分次加入），13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5．向吸附柱中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13,000rpm离心30-60秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
6．向吸附柱中加入600ul漂洗液，13,000rpm离心30-60秒，倒掉废液。
7．将离心吸附柱放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱开盖置于室温1-2分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
8．将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65–70℃预热的洗脱缓冲液20-30ul，室温放置2分钟。13,000rpm离心2分钟收集DNA溶液。注意：①为了增加回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，13,000rpm再次离心1分钟。②洗脱缓冲液体积不应少于20ul，体积过小影响回收效率。③洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5之间。
9．DNA回收产物直接后续实验或者-20℃保存。
Takara胶回收试剂盒 说明书，具体操作步骤
1. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,任何类型或等级的琼脂糖都可以使用.我们强烈的建议您使用新鲜的TAE Buffer作为电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,因为会因其PH的升高而减少产量.新鲜的TBE也可以用,但只能得到较低的产量.
2. 当所需DNA片段完全分离时,转移凝胶至紫外灯上,尽可能快地把所需的DNA片段切下来.
注:切胶时尽量把多余的凝胶切去,DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒.
3. 将带有目的片段的凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中,称重得出凝胶块的重量.近似地确定其体积.假设其密度为1g/ml(几乎所有DNA凝胶的密度都可以近似为1g/ml),于是凝胶块的体积便可通过如下方法得到:凝胶薄片的重量为0.2g, 则其体积为
0.2 ml.加入等体积的Binding Buffer(XP2),于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化,每2-3 min振荡或涡旋混合物.
重要提醒:在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少.观察混和物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5 ul 浓度为5 M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值.经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.
4. 取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干净的2ml收集管内(已备好).
5. 将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中.室温下10,000 x g离心1分钟.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.
6. 如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul,一次只能转移700ul至柱子中,余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子.每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25gDNA的吸附能力.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱子中.
7. 弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.移300ul Binding Buffer(XP2)至柱子中,室温下, 10,000 x g下离心1min.
8. 弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.移700ul SPW Wash buffer(已用无水乙醇稀释的)至柱子中.室温下10,000xg离心1min.
注意:浓缩的SPW Wash Buffer 在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释.如果DNA 洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的,须将其拿出置于室温下.
9. 重复用700ul SPW Wash buffer洗涤柱子.室温下10,000xg离心1min.
10. 弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体.
11. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入15~30ul(具体取决于预期的终产物浓度)的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上,室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA.
第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA. 如果再洗脱一次的话,可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低.
抗生素抗性基因检测实验操作步骤
本文以客户的案例为背景，介绍了实时荧光定量PCR法检测抗生素抗性基因的所需的试剂耗材以及详细的实验操作步骤。
实验摘要
以目的DNA为模板，PCR扩增获得目的片段，进行TA克隆。提取质粒，单酶切线性化，进行梯度稀释获得一系列不同浓度的标准品。通过 实时荧光定量PCR ，采用SYBR GREEN染料法，对样品进行绝对定量。
1.试剂与耗材
试剂与耗材
样品：45例土壤样品。胶回收试剂盒，美国Axygen公司，AP-GX-50。
2×Taq PCR MasterMix，南京钟鼎生物技术有限公司，PC16-1。SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒，北京艾德莱，DN27。
SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），Bµlk，宝生物工程（大连）有限公司，RR820L。Hind III，宝生物工程（大连）有限公司，1060A。
EcoR I，宝生物工程（大连）有限公司，1040A。pMDTM19-T Vector Cloning Kit，宝生物工程（大连）有限公司，6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit，北京艾德莱生物有限公司，CV1401。DL2000 DNA Plus Marker（100、250、500、750、1000、1500、2000 bp），南京诺唯赞生物技术有限公司，MD101。
1Kb DNA Ladder Marker（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 kb），南京诺唯赞生物技术有限公司，MD105-01。GelStain，北京全式金生物技术有限公司，GS101-01。
Agarose，西班牙Biowest公司，91622。离心管，美国Axygen公司，311-01-051。
枪头，美国Axygen公司。其它试剂均为国产分析纯。
2.主要实验仪器
试剂与耗材
荧光定量PCR仪，杭州BIOER，Lightcycle K。基因扩增梯度PCR仪，杭州博日，TC-96/G/H(b)C。
台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司，Allegra 21R。电子天平，美国AHOMS公司，AR5120。
恒温水浴锅，美国Amersham Pharmacia公司，MultiTemp III。紫外透射仪，美国Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25。
雪花状制冰机，日本SANYO公司，SIM-F140AY65。移液器，德国Eppendorf公司。
单人单面（垂直送风）洁净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司，SJ-CJ-1FD。
3.抗性基因检测实验步骤及结果
3.1.DNA提取
提取步骤参见SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒说明书。
3.2.DNA扩增
PCR反应体系如下：
PCR反应体系如下：
3.3.TA克隆
pMDTM19-T Vector Cloning Kit，宝生物工程（大连）有限公司，6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit，北京艾德莱生物有限公司，CV1401。
（1）将上述PCR产物切胶回收后，在PCR管中配制下列溶液：
（2）室温（20℃-30℃）连接5 min。
（3）取100 µL感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后轻弹几次将细胞均匀悬浮。
（4）加入连接产物，轻轻混匀，室温放置5min。
（5） 向离心管中加入500 µL不含抗生素的LB培养基，混匀。37℃，200 r/min，30 min。
（6）吸取复苏后细菌，均匀涂在含Amp的琼脂培养基上。37℃，倒置待平板吸收全部菌液，过夜培养。
（7）挑取阳性单菌落，PCR检测，并送样测序。
3.4.标准曲线的制作
（1）将阳性菌株，接种到含氨苄抗性的LB培养基中，37℃ 200 r/min，摇菌过夜。
（2）提取质粒，通过单酶切后，回收酶切产物。
（3）测浓度，计算拷贝数，制成标准品。
3.5.荧光定量PCR
反应体系的配制（总体积20 μL）：
荧光定量PCR扩增条件的设置：
扩增曲线：94℃ 30 s；94℃ 10 s，60℃ 12 s，72℃ 30 s循环45次，72℃单点检测信号。
溶解曲线：95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s，连续检测信号。
3.6.实验结果
您与SCI之间只缺一个： 抗性基因检测服务
钟鼎生物官网
PCR扩增目的基因大小为2500bp,但琼脂糖凝胶电泳检测发现没有扩增出目的基因？
麻烦提供更多信息，按照你目前的情况分析有以下几个原因：1、原因分析：1）引物特异性不好，不能有效扩增目的片段。2）PCR程序设置有问题，95℃ 10min，中间加上循环程序就可以了，根据扩增酶的特性进行设计 95℃ 45s 60-62℃ 30-45s 72℃ 90s左右（延伸时间根据扩增酶效率微调） 72℃ 5min3）正常情况下，模板应该是没有问题，不过也不能排除这个因素；2、建议：1）正式实验时，建议做阳性对照和阴性对照，排除实验中的污染和不确定因素，2）琼脂糖凝胶时，建议同时跑基因组DNA和实验中的阳性样本，加上maker，自然就可以找到是什么问题了。
用小剂量质粒提取试剂盒提取质粒前要做什么工作？
各公司的质粒提取试剂盒大同小异，你这个说明书可能是宝生物的试剂盒。
用试剂盒提，准备工作都比较简单：
1，摇菌；
2，准备ddH2O，无菌枪头和离心管；
3，检查溶液1是否加了Rnase，以及wash buffer是否加了无水乙醇；
3，现在天气冷，检查buffer是否有沉淀，有sds的buffer可能有会有析出，提前开水浴锅，温浴，此外，最后一步加TE或水洗脱质粒时，为提高收获量，在离心前，将柱子在50℃水浴2min更好。
若有疑问，欢迎继续讨论，纯属手打，欢迎采纳，祝实验顺利！
