公元1355年，朱元璋率领大军渡江，马氏和将士的家眷仍留在和州。当时长江交通线被元军切断，和州孤立，马氏鼓励将士，抚慰眷属，稳定后方。攻下集庆以后，由于战争的需要，她还亲手为将士缝衣做鞋。公元1360年，陈友谅率兵东下，直逼江宁，朱元璋亲自领兵抵御。强敌兵临城下，城中的官员、居民有的打算逃难，有的忙着窖藏金银，囤积粮食。马氏却镇静自若，把自己的金帛全都拿出来犒赏士兵，稳定了军心，为朱元璋获得胜利起了重要作用。
1368年正月，朱元璋登基于应天府，国号大明，建元洪武，册封马氏为皇后。
马氏勤于内治，空闲时时常探求古训，并常常以古训教导六宫嫔妃和宫女。马氏认为宋代的贤后很多，命女史录宋代家法，朝夕省览，有一个女子进言说：“宋代家法过于仁厚，不足为法，”马后正色回答：“仁厚不比苛刻更好吗?”
马皇后身边有位清江人范氏，素习女史，马皇后常令她讲解书传，谈论古今贤后事迹。有一次，范氏讲汉窦太后，马皇后听完就问范氏：“黄老是什么教?如何窦太后这样喜欢?”范氏回答：“黄老讲求清静，主张无为而治，其教化所及，臣民孝慈。”马皇后立即说：“孝慈就是仁义，世上哪有舍仁义而为孝慈的呢?”
